Proteoquant

                                                                   Dosagem de proteína
    A ciência tem avançado muito nas áreas fisiológicas. Muito deste avanço se deve às novas técnicas e ferramentas que permitem que possamos observar visualmente ou através de imagens e números os fenômenos que explicam mecanismos e reações que envolvem as moléculas nos sistemas biológicos, especialmente as proteínas.
    Hoje estamos muito mais próximos de entender como este grupo de moléculas, da maior importância para os sistemas biológicos, atuam em nível molecular. Um parâmetro importante para que possamos relativizar a possível participação de uma proteína em determinado processo fisiológico é sua concentração no ambiente onde o fenômeno acontece. Daí a importância de se fazer a quantificação de proteínas em uma amostra biológica com alto grau de confiança no resultado obtido na determinação.
    Alguns métodos estão disponíveis e são utilizados há décadas. Os mais frequentemente utilizados são os de Lowry, que envolve a reação com o reagente folin-ciocalteau, e o de Bradford, cujo reagente de cor é o coomassie blue. Além destes dois métodos, outros menos utilizados também oferecem bons resultados, como o que utiliza a prata amoniacal, ou o que utiliza a eritrosina B, ou ainda através da leitura da densidade óptica a 260 e 280 nm. O método de escolha deve levar em consideração a sensibilidade, interferência de outras substâncias, a simplicidade e.... custo.
    Todos os métodos apresentam interferência de algumas substâncias comumente utilizadas no processo de obtenção da amostra biológica. Sais e detergentes são os maiores vilões neste quesito, pois podem interferir na dosagem de forma significativa dependendo de suas concentrações no meio. No entanto, caso queira reduzir drasticamente a interferência destas substancias em sua dosagem e obter resultado mais próximo do real, sugerimos passar a amostra por uma centrifugação usando um tubo centricon. Por este processo, além de “lavar” sua amostra, ou seja, retirar substâncias indesejáveis, você poderá também aumentar a concentração de proteínas, caso seja conveniente.
    Homogenatos de amostras de massa de tecido muito pequena, geralmente de estruturas cerebrais, apresentam concentrações muito baixas, e o centricon pode ajudar no processo de concentração da amostra. Mas fique atento ao tipo de centricon adequado para sua amostra. Os níveis de interferência de alguns sais são diferentes dependendo do método utilizado. Independente do método utilizado, estes envolvem a espectrofotometria como ferramenta de quantificação. A espectrofotometria, pelas suas características que iremos discutir mais adiante, permite alta especificidade e boa sensibilidade.
    Tão importante e difundida é a ferramenta que espectrofotômetros podem ser encontrados em praticamente todos os laboratórios do mundo. No entanto devemos saber como utilizar a técnica e para isso precisamos discutir alguns aspectos incluindo seu princípio. O princípio envolve a interação de um feixe de luz com a matéria e a específica absorção da luz por alguma molécula presente na amostra. Informações detalhadas sobre espectrofotometria podem ser encontradas no livro Biofisica Basica 2ª edição, da editora Atheneu.

Ultra violeta
    Método mais simples, mas de menor sensibilidade e sujeito a maior erro devido à possibilidade de componentes não proteicos interferirem na leitura da densidade óptica (DO), além do fato de que proteínas diferentes apresentam valores diferentes de leitura devido à composição de aminoácidos.
    Por isso pode ser utilizado para se obter uma informação inicial dos níveis de proteína em uma amostra, sem necessidade de exatidão. Com dados de DO da amostra obtidos a 280 e 260 nm e utilizando-se da fórmula CP = 1,45 x DO₂₈₀ – 0,74 x DO₂₆₀ obtém-se o valor aproximado da concentração de proteína na amostra. 

Lowry
    O método de Lowry é bastante utilizado para amostras cuja concentração de proteína seja relativamente alta, devido a sensibilidade do método. Por este método é determinado a concentração total de proteína de uma amostra.
    Além de apresentar sensibilidade relativamente menor, apresenta maior sensibilidade a interferentes. O princípio do método baseia-se na redução do reagente folin-ciocalteu (FC) ao reagir com proteínas na presença do catalisador cobre 2⁺.
    O reagente FC é formado por uma mistura contendo molibdato e tungstato. Dois passos reativos levam à formação do complexo colorido, que apresenta, na curva de absorção espectral, pico de máxima absorção em torno de 750 nm.
    O primeiro passo envolve a redução do cobre 2⁺ em condições alcalinas, formando complexo com as ligações peptídicas. Esta redução ocorre diretamente através das cadeias laterais de alguns aminoácidos (tirosina, triptofano, cisteína, asparagina e histidina).
    A segunda reação envolve a redução do reagente folin-ciocalteu pelo complexo cobre-ligação peptídica, causando uma mudança na coloração da solução para azul. Por espetrofotometria pode ler-se as amostras tratadas com este método entre 650 a 750 nm.A quantidade de proteína pode ser estimada utilizando uma curva padrão com outra proteína, isto é, cuja concentração seja conhecida como a albumina bovina sérica.
    A principal vantagem do método de Lowry está relacionada a sua sensibilidade, é mais sensível que a determinação UV e também mais sensível que o método de Biureto. Algumas desvantagens são o tempo da reação, e a incompatibilidade com detergentes e agentes redutores.

Coomassie-blue
    O método descrito por Bradford em 1976 é o mais difundido para esta finalidade. O principio envolve o reagente coomasie blue G-250 (Cb), que, em meio ácido, se apresenta na forma catiônica, de cor vermelha.
    O coomassie blue G-250 pode se apresentar ainda na forma verde, em pH neutro, ou na cor azul, em pH alcalino. Para que se possa usar o corante com essa finalidade, o mesmo deve estar em pH ácido, na forma catiônica, que se liga fortemente à proteínas, formando um complexo. Com a ligação e formação do complexo, Cb muda para a forma aniônica, e consequentemente para a cor azul, que absorve fortemente em 595 nm, sendo a intensidade da cor, ou quantidade do complexo, proporcional à concentração de proteína na amostra. Juntamente com as amostras que se quer determinar a concentração de proteína, coloca-se para reagir uma proteína padrão, de concentração conhecida, normalmente a soroalbumina bovina (BSA).
    Com os resultados obtidos em termos de cor para a BSA determina-se a quantidade de proteína nas amostras desconhecidas. No entanto é necessário que se faça uma curva padrão com a BSA, determinando-se a intensidade de cor azul em amostras de BSA em quantidades diferentes e sabidas. As leituras da densidade óptica (DO) das amostras de BSA aumentam com a quantidade da proteína.
    Dessa forma teremos a curva padrão, que apresenta linearidade crescente de DO (ou absorbância) em função da quantidade de proteína. A proteína (P) reage com o Cb e forma um complexo C, azul, que absorve a 595 nm, como na reação abaixo: 
                                                                               P + Cb → C (azul)
    Na reação a concentração do Cb é mantida constante em todos os tubos e o que varia é a quantidade ou concentração da proteína, o que define a intensidade da cor azul e, portanto a absorbância a 595 nm.
    Na verdade, o aumento da absorbância se dá de acordo com a lei de Lambert-Beer, que diz que a absorbância é proporcional à C (concentração do complexo, que depende da concentração ou quantidade de proteína), de uma constante ε (que mede a capacidade do complexo absorver a luz de 595 nm), chamada de coeficiente de extinção molar, e do caminho percorrido pela luz dentro da solução (Ɩ), chamado caminho óptico. Portanto,
                                                                             A = ε C Ɩ
Como normalmente nos espectrofotômetros o caminho óptico vale 1, a equação fica resumida em:
                                                                  A = ε C  ou  ε = A/C
    A fórmula A = εC pode ser escrita também da forma A = εC + 0 (equação de uma reta, y = ax + b), pois o zero altera em nada a resultante, mas nos ajuda a entender que a absorbância de uma substância em função de sua concentração é uma reta que passa pela origem, sendo o zero o intercepto da reta no eixo Y. Uma curva padrão hipotética está mostrada na figura abaixo:
 

    Como é esperado, uma reta normalmente utiliza-se a regressão linear para se determinar a concentração de proteínas em amostras biológicas, pois com a determinação dos parâmetros da reta (coeficientes linear e angular), fica fácil determinar a concentração em dezenas de amostras rapidamente. Mas essa prática nos coloca em uma armadilha, levando-nos a obter resultados com erros significativos, como veremos em seguida.
    Em 30 anos de aulas para a pós-graduação cheguei à conclusão que discutir este tema é da maior importância científica, pois, observei que a maioria dos alunos, tanto de mestrado quanto de doutorado não sabia exatamente o que estavam fazendo quando executavam experimentos de dosagem de proteína de suas amostras e, inúmeras vezes deixavam claro que estavam “meio perdidos”, pois seus orientadores não sabiam como ajudá-los. Sempre usavam a regressão linear, pois aprenderam que deveriam ter como resultado uma reta na curva padrão.      Penso hoje que, quase que certamente, boa parte dos trabalhos publicados, cravados na literatura, carrega erros importantes, erros esses relacionados à concentração de proteína considerada pelos autores e que pode levar a conclusões equivocadas, devido principalmente à atividade específica de uma proteína, parâmetro que depende de uma dosagem bem feita.
    No entanto, na prática, o que se observa nas curvas padrão, é que acontece um desvio da reta quando se aumenta a concentração (ou quantidade) de proteína. Esse desvio é conhecido como desvio negativo da lei de Beer. A figura abaixo mostra como isso acontece. 
 

    Esse desvio, pelo fato de algumas vezes ser sutil, fica despercebido pela maioria das pessoas que se utilizam da técnica, mas reflete de forma significativa nos parâmetros da regressão linear, pois diminui o coeficiente angular (inclinação ou a tangente da reta) e aumenta o coeficiente linear (intercepto da reta em y) e conseqüentemente interfere no cálculo da concentração de proteína na amostra.
    Caso eu faça a regressão linear (curva B, pontilhada), estarei admitindo que o ε é o mesmo para todos os pontos e assim erroneamente deverei subestimar ou superestimar a concentração de proteína das amostras.
    Normalmente as pessoas não prestam atenção nestes parâmetros, mas somente no coeficiente de correlação, que não ajuda muito nesta análise. Uma forma de corrigir este problema é determinar a concentração de proteína na amostra utilizando o método das tangentes.
    Pelo método das tangentes deve-se calcular a tangente de cada ponto da curva padrão, dividindo A por C, e dividir o valor da leitura da densidade óptica da amostra (já subtraído o branco) pela tangente do ponto da curva padrão cuja densidade óptica está mais próxima da densidade óptica da minha amostra, fazendo: 
                                                                        C = A/ ε 
    Desta forma podemos corrigir o efeito causado pelo desvio negativo da lei de Beer. Ainda assim estarei cometendo algum erro na determinação, mas com certeza o erro será bem menor que aquele obtido com a regressão linear. Em alguns experimentos essa diferença no erro pode chegar a 20%. É importante ressaltar que o desvio negativo da lei de Beer é muito comum e pode acontecer em todos os ensaios que utilizam a leitura espectrofotométrica.